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浅谈层析实验中的气泡问题
2022.08.24   点击2948次

说到气泡,你可能会联想到酣畅淋漓的可乐,通透上头的啤酒,亦或是流光飞舞的浪漫,生活中的气泡,似乎还带有那么一丝美好,然而对于实验来说,尤其是在大多不会配置在线脱气单元的FPLC系统上做的层析实验,气泡就如烦人的苍蝇,鞋里的石子,令人如鲠在喉不吐不快,如若是重要样品、昂贵填料,气泡带来的实验失败那简直是小型灾难现场。那么气泡是源自何来,而又去之何处,怎么能让它们从我们的系统里消失,以下此篇,做一个小小探讨,抛砖引玉,共谋对策而灭之。

关于气泡来源,正如病从口入,无非就是进入系统的开口处:流动相,或者流路中相对负压处的漏点;如果流动相脱气不理想或仪器本身连接管路、组件存在问题,流路中将形成肆意妄为的气泡,引发一系列问题:

1、组分峰面积变化,峰形变化;

2、形成尖峰或锯齿状噪声;

3、出现鬼峰 ,基线漂移波动增大;

4、泵动作失常,压力波动,检测基线全抖;

5、填料走空,干柱;

6、溶解氧可能氧化样品组分和(或)流动相及固定相组分,使检测失真。

实际案例

Fig.1气泡造成的UV杂峰

Fig.2气泡造成的系统压力波动

这些症状基本能覆盖大部分的层析实验问题,可见气泡的破坏力和恼人程度,知己知彼方才能有的放矢,那么气泡是如何形成的呢?流动相中气体形成的原因有多种,*根本的还是由于气体在液体中达到过饱和状态;平衡状态时溶解空气的量与溶液的性质、气体的种类有关,也与外界条件有关,主要的外界条件有以下 3种。

1、温

一般来说,溶剂中能溶解气体的量随温度的升高而降低,而当溶剂从低温状态下移至高温时,过量溶解的气体以气泡形式逸出。因此,缓冲液温度的变化,较易引起气泡的形成。

●正如我们配置的缓冲液很多时候会保存于层析柜的低温环境,当实验需要使用时从层析柜中取出,在室温环境下会带来温度的剧烈变化,改变气体溶解性,进而产生气泡,影响实验,因此缓冲液的使用如果有温度的变化,需要在实验温度下摆放一段时间,释放气泡后再使用;

●如果层析仪器是在非恒温实验室,昼夜会有温差,白天做完实验系统保存,经历夜晚的温度变化,第*二天系统里很可能会出现气泡,此时实验之前充分System wash就非常重要,需要使用高流速将系统内的气泡吹扫出来,避免影响实验。

●当检测器池处于较高温度时,池中易产生气泡,因为液流通过检测器时,温度升高而此处的压力反而减小。如果气泡形成于检测器池中,则将出现尖峰状或锯齿状的基线噪声,甚至于完全无法测定,因此在系统流路中,升温组件与流路保持相应的温度隔断,系统流路温度的均一性,也非常重要。

2、压力降低

气体的分压增高,气体在溶剂中的溶解量增大,相反在较高压力下达到饱和的溶液,一旦压力降低便会产生气泡。这也是实验中气泡产生的重要原因之一,如:

●层析仪的缓冲进口一般都有滤网设计,如果滤网维护清洁不到位,滤网杂质过多或者长菌造成液体通量不足,在较高的流速情况下,管路内部的压力急剧降低,此时气泡将会闪亮登场,带来波浪般的图谱波动;因此实验之前需要检查系统缓冲液进口滤头的清洁情况,如有杂质需立刻清洗去除。

Fig.3缓冲液进口滤头筛网

●配置缓冲液时的气压高(气温,湿度,天气和海拔都会影响大气压),瓶子拧紧后保存,如果实验时的气压有变化,在打开缓冲液进行实验时,就会带入析出的气泡,因此,预配置缓冲液的脱气就非常重要。

●系统中的不同管径流路的转换,带来通量的改变,比如细管转粗管,在高流速情况下,由于通量的骤升,形成局部负压,容易引发气泡的析出或漏入,所以系统管径的使用要尽量避免细管转粗管,如果实验必须,则要注意避免使用高流速。

●低压梯度时,由于低压梯度单元部位的压力略低于大气压,且混合室多装在泵后(高压侧),但实际混合在低压侧就开始了,所以,低压梯度比混合发生在泵后的高压梯度容易产生气泡。(常规单泵二或四通道的均为低压混合模式)

●色谱柱中的压力一般较高,气体溶解度增大,一般在柱中不易产生气泡。然而,在接近柱的出口处,压力相对较低,柱体填料的进出口压差会很大,此时流动相里溶解的气泡由于压力差,极易在填料中析出,影响柱效,甚至损坏填料,因此系统里会配置反压装置(如背压阀),给柱后施加一定的反压,降低柱内压差,从而避免气泡的析出。

3、溶

气体的溶解量与气体的种类有关,也与溶剂的种类有关。通常极性低的气体容易溶解于低极性的溶剂,极性高的气体容易溶解于高极性的溶剂。通常当两种不同的溶剂混合时,混合溶剂中溶解的空气量也将发生变化。大量实验证明:混合溶剂中溶解的空气量比各个纯溶剂的空气溶解量要小。

●配置缓冲液时,大多会进行不同液体的混合,液体热力学体积的变化,和放热吸热,都会产生气泡,如配置20%乙醇溶液,酸溶液,盐溶液,乙腈溶液,会明显有气泡产生,此时就需要对溶液进行静置或脱气操作,才可用于实验。

●在层析实验中,有很多溶液混合的操作,如置换缓冲,洗脱等等,所以一些溶液的混合需要尽量避免,比如乙醇溶液和盐溶液,需要用纯水隔开,否则易造成气泡析出,所以当乙醇溶液保存的系统需要进行实验时,缓冲液是盐溶液如PBS,我们就需要用纯水先做系统冲洗,再做PBS的填充。

Fig.4缓冲液中析出的气泡

●如果实验设计中,不可避免的需要两种不同极性溶剂的混合,还要避免气泡,则需要从混合处想办法,一般的层析系统两相溶剂的混合是在有搅拌装置的动态混合池中进行,混合剧烈,容易析出气泡,此时可以考虑将动态混合器改为静态混合器,让溶剂的混合方式由剧烈变为温和,会有较好的避免气泡的效果。

Fig.5动态混合器和静态混合器

另外,除了溶液带入,系统中的漏点也会引入气泡,尤其是未加压的低压流路,在管路接头、阀和转子等分离结构位置,容易产生漏点,系统中如果发现有气泡造成基线波动,而在溶液进口又没发现可见的气泡,则需要在系统内查找漏点,有效的办法是用透明的ETFE管代替不透明的Peek管,观察是哪一段出现的气泡,以便判断漏点,及时处理。

Fig.6管路中漏入的气泡

关于溶剂的脱气方法,目前常用的有两种:超声脱气和负压脱气;超声脱气就是利用超声锅或者超声探头,当高功率超声波耦合到液体中时,液体分别在高压和低压循环中被压缩和膨胀,在低压循环中,会产生微小的真空气泡(所谓的空化气泡),这些气泡会在多个压力循环中增长。在气泡生长的那些周期中,液体中的溶解气体进入真空气泡,这样真空气泡就变成了不断增长的气泡。超声脱气特点是操作便捷,效率高,脱气快,一般10-15分钟的超声可以去除溶液中大部分气泡,缺点是容易发热,需要降温,注意在用超声锅脱气时,溶剂瓶盖要拧松或者拿掉;负压脱气是利用机械产生负压的方式使溶液中的气泡析出,一般分析型色谱仪或者需要高精度检测的仪器,在流路中配置在线脱气单元,都是利用负压的原理进行脱气,实验室常用的是真空抽滤装置,既能过滤溶液,又能脱气,实用性高。

Fig.7超声脱气

Fig.8真空抽滤装置

如果层析系统的流路里混入了气泡,首先是要进行大流速的system wash,可吹扫出大部分的气泡,然而有些微小气泡仍然是不容易冲出的,在可见透明管中的细微气泡可用外力敲打让其脱离管路内壁而冲出,但是系统内部,尤其是泵腔,单向阀,检测器流通池内的细微气泡,不可视,也不能外力敲打,所以无法判断是否冲洗彻底,滞留在柱塞泵单向阀或者检测器流通池的微小气泡仍然会给层析图谱带来波动影响,此时我们可以使用无水甲醇或乙醇来做system wash,*好加一定的反压,因为甲醇或乙醇试剂降低了气-液界面张力,甲醇(乙醇)分子不能形成坚固的膜,于是气泡破裂或者从流路内壁脱落,从而带出了流路中的各种细微气泡,达到系统脱气的目的;而另一方面,系统内部流路的清洁程度也是影响气泡滞留的重要原因,FPLC系统经常会过复杂的生物质样品,如果日常冲洗不充分,流路内壁容易形成脏污,会增加对微小气泡的顽固吸附,影响实验,因此定期的系统全*面清洗,对于排除气泡也是至关重要。

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